微生物共培养技术日益引起重视，共培养系统技术使新的生物精炼平台的开发成为可能，以通过可持续的生物转化过程获得生物燃料和高价值化合物。国际著名期刊Bioresource Technology发表文章描述了未来共培养系统发展与应用方向，提出设计共培养系统构建新的生物精炼平台的设想。

1.背景

工农业的加速发展产生大量废弃物物，污染环境，对生命健康产生负面影响。找到一种适宜的废物处理技术是关乎人类未来可持续发展的重要问题。微生物技术是处理和利用不同废物的有力工具，使用几种纯培养物或微生物混合物可以获得多种高附加值化合物（即丁二酸、富马酸、苹果酸、低聚木糖、糠醛、5-羟甲基糠醛、酚类化合物、甲酸等）。

目前，生物技术产业传统上是基于无菌培养物或单一培养物的使用，因为其易于监测、对代谢途径了解以及符合严格的生物安全法规。然而，使用单一培养物的问题是其高污染风险，从而导致经济和社会效益的下降以及运行期间大量原料损失。克服这些瓶颈的一种方法是使用共生共培养物，已证明能够避免污染问题，且易于适应环境变化。此外，共培养物通过相关微生物协同代谢能显著提高生物量和高价值产品的产量。

自20世纪以来，已报道使用微生物共培养作为使用复杂基质的有效方法，以通过激活隐藏在其他微生物中的生物活性途径来生产高附加值化合物，这是因为99%的微生物以自然形式存在于环境中。共培养系统代表了一个潜在的创新平台，用于生成生物复合物，如乳酸、丙酸、戊酸、柠檬酸、亚麻酸、亚油酸、类胡萝卜素和黄嘌呤，而无需在一些非模型微生物中加入大型或复杂的异源途径，增强环境可持续性并发展循环生物经济。

2.微生物共培养

共培养是两种或两种以上不同生物体共存的生物系统，它们在自然或人工方式的培养基中以一定程度的接触生长。共培养系统自然存在于各种哺乳动物的肠道、食物、土壤、水体和废物中。它们在废水处理、新药开发、土壤生物修复、碳捕获和储存、生物燃料生产和高附加值化合物生产有广泛应用。

共培养系统中的共生关系包括共生和共栖，这种协同作用通常涉及释放用于营养目的的分子，如植物激素和生长促进剂。另一方面，共培养系统也可能是寄生或掠夺，这包括释放抑制微生物生长的毒素、抗生素和生物碱。共生共培养系统的一个例子是微藻和硝化细菌共同培养，用于处理城市和工业废水。微藻能同化无机碳（CO2）、氮（NH4+、NO3−, 二号−), 和磷(PO4)−) 微藻在生长过程中会产生氧（O2）碳水化合物、脂质和蛋白质。细菌利用微藻释放的O2作为电子受体分解废水中的有机物，并由此释放CO2以及一些刺激微藻生长的生长促进剂。微藻和细菌作为共培养系统可促进废水中的相互生长，以去除有毒物质，并获得富含化合物的微藻生物量，这些化合物可回收并转化为非食品化合物，如生物燃料、色素、油和树脂。

3.天然共培养系统在高价值化合物生产中的应用

共培养系统的使用始于对某些物种的生物行为及其在生态系统中的作用的观察。传统的食品发酵过程是微生物之间的第一个共生组合，这些微生物组合在生物分子生产中起着重要的作用，这些生物分子影响了奶酪、啤酒、乳制品、香肠和一些酱汁等食物的味道和质地。通过使用共培养系统（青霉和葡萄球菌）导致1929年亚历山大·弗莱明偶然发现了青霉素。这一生物产品被认为是20世纪最重要的科学发现之一。

由于对感官、健康、营养和卫生特性的积极影响，主要在乳制品发酵中开发的天然菌群介于乳酸菌（LAB）和酵母之间的这种共生关系，酵母向乳酸菌提供必需的氨基酸和维生素，并调节培养基中乙醇和乳酸产生的pH值。

自然共培养系统的例子是嗜酸铁浆菌和嗜铁钩端螺旋菌之间的共生关系，它们共存于酸性矿山排水中，嗜酸铁浆菌利用嗜铁钩端螺旋体分泌的有机物质进行生长，保持培养基中有机化合物的低水平，并防止其对嗜铁钩端螺旋体的毒性作用。通过这种方式，嗜酸铁浆菌有助于氧化氮和含硫矿物。

含水生态系统中的微藻生长是一种自然行为，微藻之间的这种共生现象经常被自然界用来去除河流、湖泊和池塘中的氮和磷，从而避免水资源污染和水体富营养化。其他自然共培养是土壤细菌雷帕霉素链霉菌和构巢曲霉之间的相互作用。这种相互作用诱导沉默真菌基因簇的表达，以产生具有抗氧化生物活性的蝶呤酸。

在根际观察到的控制植物病害的一个很有希望的例子是真菌木霉和贝莱斯芽孢杆菌之间的相互拮抗作用。贝莱斯芽孢杆菌产生抗真菌化合物，如杆菌霉素D和丰霉素，对丝状真菌孢子起拮抗作用，从而抑制木霉菌的生长。该共培养体系的使用减少了对合成农药的依赖，使其成为可持续农业和食品安全生产的重要组成部分。

自然共培养系统的研究为人工微生物共培养系统的设计和新型生物分子的开发提供了新的视野。因此，了解细胞间通讯机制所涉及的生物合成途径有助于了解沉默代谢途径的激活，尤其是在开发新药物方面。此外，利用使用不同菌株的廉价基质以及开发生物加工策略，以使用微生物共培养的生物精炼平台，从而实现可持续经济（循环经济）。

微生物共培养系统的作用

要理解微生物共培养的作用，必须要了解微生物群落之间的相互作用是什么？互惠、共栖、竞争或非共生？每个微生物之间的营养交换（碳水化合物、氨基酸、维生素或核苷酸）是互惠关系的基础。当共存的微生物中的一种受到另一种微生物相互作用的青睐，并且没有受到任何好的或坏的影响时，就会发生共生现象。在竞争中，两个或两个以上的微生物在生长过程中竞争相同的能源，对两个部分都产生负面影响。对联合体内微生物的一种抑制形式可以是生产抗生素，如四环素和卡那霉素，这些抗生素可阻断调节蛋白质合成的酶的活性。其他形式的微生物抑制是通过群体感应（QS）阻断。

原核生物-原核生物和原核生物-真核生物相互作用中的细胞间通讯机制之一是小信号分子的细胞间交换，如N-酰基高丝氨酸内酯（AHL）、自诱导物（AI-2）和自诱导肽（AIP）。AHL是革兰氏阴性菌联合体使用的主要自诱导信号分子，由LuxI型合成酶合成。一旦环境中的AHLs浓度达到阈值水平，AHLs就会同时激活临界量细胞中LuxR家族的转录调节蛋白。LuxR/AHL复合物可以激活多个目标基因的表达（沉默基因簇的表达可诱导新的代谢途径），包括AHL合成所需的基因。

在革兰氏阳性菌联合体中，AIP主要用作信号分子。与AHL不同，AIP在序列和结构上有所不同。AIP通常采用由组氨酸激酶（HK）和DNA结合反应调节器组成的双组分遗传调节机制。一旦AIPs在细胞外环境中达到临界浓度，它就会被受体HK磷酸化并导入细胞。磷酸化AIP结合在目标DNA上以调节其转录，从而在不同种类的革兰氏阳性细菌中形成运动性和生物膜。

在废水处理系统中，已通过存在多形亚硝基螺旋体、布氏亚硝基螺旋体和普通亚硝基杆菌来确定AHL，这些细菌可能参与胞外多糖（EPS）合成、生物膜形成和脱氮。这些信号分子参与基因表达，协调细菌对种群密度的生理行为，因此细菌表现出各种生态功能。这种类型的通信称为QS。

在共存多个微生物物种争夺相同资源的生态位中，破坏QS的能力可能使一个细菌物种比另一个依赖QS的细菌物种更具优势。同样，宿主阻断或灭活细菌细胞间通讯的能力对于防止使用QS的病原菌定植可能至关重要。这种细胞间通信（QS）的干扰机制被称为群体猝灭（QQ）。

阻断QS信号分子合成的方法是通过l/d-S-腺苷高半胱氨酸、sinefungin和丁基-S-腺苷甲硫氨酸（丁基SAM），这些分子是合成LuxI蛋白的类似物，LuxI蛋白可自动诱导AHLs生物合成。QS信号分子的阻断被认为是最有效的抑制细胞的方法，因为这种作用可以在体外有效地进行。QS分子的阻断机制是通过酶作用实现的，因为一些细菌具有产生乳糖酶和酰化酶的能力，其功能是水解AHL型自诱导剂的环酯或酰胺键并破坏细胞间通信。

了解微生物群落的细胞通讯机制、生态功能和进化原因将有助于模拟自然环境（合成群落），利用基因表达产生高附加值化合物，为了克服将大量DNA转移到模型微生物中而不存在遗传污染风险的需要。这种知识还可以节省时间和实验，以获得成员之间的积极互动。

5.共培养系统设计

合成微生物共培养系统的设计主要基于微生物之间的相互作用模式，包括一个物种分泌的小分子或电子与另一个物种消耗的小分子的交换，以及通过信号分子相互作用（QS）的细胞间通信机制，其工业用途的成功取决于以下特征：•无毒，•能够共存，•具有相似的生长速率，•提供营养和/或刺激物以促进生长，•不会造成产量不足和生长延迟，•提高使用多种原料的能力，•去除抑制分子，并•具有将微生物废物用作饲料的能力。

通常，设计合成微生物共培养系统的许多研究都是从许多实验开始的，在这些实验中，微生物的各种组合具有正相互作用或负相互作用。这有一个优势，即赋予联合体丰富的微生物，这意味着不同的菌株同时执行各种复杂的活动。这种方法的缺点是需要大量的实验，很少有人了解细胞间的生物相互作用及其通讯机制。

Jia等报告设计和构建微生物共培养有两种方法。第一个是建立一个微生物人工群落，模仿自然微生物群落的功能。作为模型系统，以受控方式评估其生态、结构和功能特征。功能群落的一个例子是通过消化或减少废水处理厂的有毒化合物产生沼气，这些物质的产生或分解可以作为微生物群落功能的客观衡量标准，之后，将从多组学分析中详细描述群落的动态，以探索交流的分子机制。这种设计和构建微生物共培养的方式被称为自上而下（从简单到复杂）。这种设计策略允许长期测量参数，如功能稳定性、性能以及这些参数与群落组成的相关性，但其缺点在于我们准确测量复杂群落中物种多样性的能力有限。

另一种方式是从确定微生物群落中的共同交互模式和过程开始，目的是这些交互模式可能是整个群落结构和动态的关键决定因素。通过这种方式，在工程原理的帮助下，通过基因元件、模块、基因电路和代谢途径或网络分析相互作用模式，以获得具有更高效率、稳定性和控制能力的微生物共培养系统。这种策略被称为自下而上（从简单到复杂）。

Kong等报告了通过模块化路径重构方法创建的几个具有不同生物相互作用的体系。这一概念始于单个模块（基因电路）中完整代谢途径的调节，其排列方式使所需基因通过单个菌株表达，这种方式避免了组装单个DNA部分。由于本地基因网络的高度模块化，模块化重构可以成为电路工程的有力工具。通过这种方法，Kong等研究了乳酸乳球菌NZ9000中抗菌和QS分子和乳酸菌素A（lcnA是一种抗菌肽）生物合成途径的模块化重组，以获得有助于创建新型合成微生物体系的可编程细胞。这种模块化途径重组的结果允许构建具有不同生物相互作用的乳酸乳球菌双菌株联合体。

微生物共培养体系的模块化路径重构

“973”项目报告的一个研究案例是一步发酵维生素C的微生物体系的设计和建造。传统工艺基于两步发酵，即通过氧化葡萄糖酸杆菌将d-山梨醇转化为l-山梨糖，然后通过芽孢杆菌属和酮古龙尼菌的作用产生2-酮基-l-古龙尼酸（2-KGA，维生素C的前体），其中酮古龙尼菌作为生长促进剂，负责从l-山梨糖生物合成2-KGA。Bacillus spp.-ketogulonigigenium vulgare consortium的代谢组学和蛋白质组学分析表明，Bacillus spp.作为营养素的替代来源，因为它具有叶酸、原血红素、泛酸和辅酶A的完整生物合成途径。通过对芽孢杆菌-酮古龙尼氏菌之间关系的深入理解，可以通过氧化葡萄糖酸杆菌-酮古龙尼氏菌的合成联合体将维生素C的发酵过程简化为一步，其生物相互作用从共栖和竞争转变为互惠，当提供营养时，由芽孢杆菌在培养基中提供。在一步发酵中，2-KGA的最终浓度为76.6 g/L，与需要两个灭菌过程的传统两步发酵（约90%）相比，2-KGA对抗d-山梨醇的产量在36小时内达到89.7%。这种新型的维生素C生产共培养体系将发酵时间缩短了约25%，并消除了第二次灭菌过程的需要。

微生物共培养一步法生产Vc

设计人工微生物群落的能力最终能够更好地理解微生物之间的代谢相互作用，从而充分挖掘微生物世界的代谢潜力，获得新的高附加值化合物，以稳定和强健的方式维持细胞生长。

6. 当前共培养技术

人们对理解微生物群落在自然界中的行为越来越感兴趣，这使得合成生物学得以发展。这项技术使用工程方法，包括计算模型和模块化DNA部件，以诱导新的代谢途径，并构建生物回路，以逻辑方式控制微生物体系的行为。因此，合成生物学工具，如；细胞间信号（包括QS）、外源分子和共营养相互作用分别有助于构建生物体之间的通信系统、控制特定种群行为和构建微生物的相互依赖网络。

使用外源分子测定特定群落成员的代谢途径，使用标记底物，如葡萄糖，可被许多生物体代谢，可以建立和开发复杂的代谢图谱，从前体分子（底物）转化为产物、化学平衡和生物催化剂的基本作用等概念提供了细胞代谢的综合视图。通过使用代谢图谱，可以通过交叉喂食形式的连续资源交换获得新的微生物联盟形状（Y形，包含两个头和一个身体），这允许模拟自然联盟生产新型高附加值化合物的能力。生物回路的设计在细胞行为中起着重要作用，因为它阐明了细胞中的外部和内部信号，从而在微生物群落中诱导适当的生理反应。

基因电路的概念设计是从电气工程中采用的一种类比，它允许构建一种语言来编程具有特定生物相互作用的细胞，以生产药品、生物燃料和精细化学品。细胞信号电路的特点是其决策子系统充当传感器和处理器（如受体及其效应器），最终控制各种响应子系统，如基因表达，在外部环境条件下控制微生物群落内的预期行为。基因回路的发展为预测和评估细胞过程的动力学提供了一个框架，从而导致细胞控制的新逻辑形式，在微生物联盟的设计中有着重要的应用。合成生物学提供了一种多功能的方法，着重于如何将单个分子部分组装成执行复杂行为的系统，从而能够设计和构建在环境信号存在的情况下控制的合成生物路径。

另一种有助于理解微生物联盟行为的方法是使用组学工具，如基因组学、蛋白质组学和代谢组学。这些工具有助于通过细菌16S rRNA克隆文库测序和酵母菌26S rRNA克隆文库测序分析微生物群落中的DNA、RNA、蛋白质和细胞间相互作用，从而揭示微生物群落内部的微生物组成。组学工具的使用必须辅以质谱技术和RNA序列，以了解参与高附加值化合物分泌过程的细胞途径和基因。.

7.共培养是优化增值化合物的可靠选择

一旦在代谢分析中确定了微生物群落与其功能模块之间的生物相互作用，以生产对外界干扰稳定的目标化合物，就可以进行操作参数的优化方法（即pH值、温度、底物浓度、搅拌、通气、培养基组成和接种量，这是控制发酵过程的一些关键因素）为了使高附加值化合物的生产变得可行，从而实现高产量和经济高效的工艺。优化微生物联合体发酵工艺的另一个原因是，该方法已成功应用于各种生物制造工艺中。

微生物共培养法是一种稳健的共培养设计方法，已成功应用于多种生化物质的生产，如柚皮素生产（柚皮素是一种天然产物，具有抗氧化、抗癌、减肥和抗炎活性）通过共培养中大肠杆菌P2C和大肠杆菌BLNA之间的异源生物合成作用。在该共培养系统的优化中，当大肠杆菌P2C和大肠杆菌BLNA之间的接种物比例为1:5、接种后6小时诱导并在葡萄糖中生长至30°C时，柚皮素的最高产量为16.7 mg/L。Akdemir等报告了通过基因工程大肠杆菌菌株开发和优化共培养，以从葡萄糖、酪氨酸和儿茶素等简单前体生产复杂的吡喃花青素。该共培养系统使用4-乙烯基苯酚（VP）和4-乙烯基儿茶酚（VCAT）大肠杆菌菌株中的产生子模块与花青素-3-O-葡萄糖苷（C3G）产生子重组细胞一起获得吡喃花青素-3-O-葡萄糖苷-苯酚和吡喃花青素-3-O-葡萄糖苷-儿茶酚。最高吡喃花青素生成量（8.5 mg/L）当菌株之间的接种比例为1:1时，可达到此效果，在此条件下，吡喃花青素的形成不受诱导时间的影响。

8.机遇和挑战

在生物技术产业中实施共培养系统的好处有：•减少与无菌培养（单一培养）相关的污染问题，•缩短培养时间，•从微生物组合中诱导新的代谢途径，从而产生新的生物产品，•提高生物工艺生产率，•增加复杂基质的使用，•减少人为污染问题，•允许以可持续的方式为高价值化合物生产设计生物精炼平台，并•降低与原料和灭菌方案相关的生产成本。

与使用共培养系统相关的主要挑战是：•理解和模拟以满足每个细胞理想要求的方式培养的菌株之间的自然代谢协同作用，•稳定生物行为（维持内环境平衡）在联合体内部，主要控制过程，•将分离技术的能源成本降至最低，用于从微生物生物质中提取高附加值化合物，•生物反应器设计，增强培养基内部的传输现象，以增加细胞密度，•确保执行食品和药品管理局制定的法规管理局（FDA）机构，以确保人类和环境中使用共培养的安全性，并•使用代谢途径的数值积分分析工具，允许模拟自然栖息地，以确定共培养系统的兼容性。克服共培养系统面临的挑战是实现生物产品工艺放大和盈利生产的关键，这也允许开发适合循环生物经济方法的生物技术生产平台。

9.基于共培养架构的生物炼制

化石燃料的一种替代方法是设计生物精炼平台，通过可持续的方式，通过单元操作步骤进行生物质转化，获得生物燃料、能源和高价值化合物。这一生物炼制概念与共培养系统的设计非常吻合，因为它们可能有助于减少环境污染，可用于废水处理、生物能源和生物燃料生产、有毒物质生物降解、土壤和空气生物修复，反过来生产高价值化合物，如维生素、抗氧化剂、酶、聚合物和色素，这赋予了开发生物精炼平台的巨大潜力，其主要目标是通过成本效益和生态友好的工艺生产高附加值化合物。生物精炼提供了一种融入循环生物经济的解决方案，其中生物质被用作几种化合物生产的原料，所有副产品都是完全可降解的。

生物精炼示意图

10.在生物精炼系统中发展共培养的问题

关于综合共培养和生物精炼系统的能源方面，重要的是考虑所有过程中的能源消耗。这涉及培养阶段（共培养生长）消耗的能量，这与生物反应器的工作、培养基中营养素的补充、过程控制以及获得生物复合物所需的下游加工有关。

另一个需要解决的问题是尽量减少淡水的使用和化石资源的供应，因为最终目标是优化资源的使用，最大限度地提高盈利能力，并尽量减少废物的产生。淡水的使用将通过生物量回收步骤后的循环水或通过使用废水来解决。与此同时，化石资源的供应将通过替代碳源解决，如二氧化碳、各种农产工业废物以及工业和城市污水。最小化这些资源的使用，生物炼制平台可以转化为可再生的过程和碳中性的。

11.基于共培养工艺的可持续生物精炼发展趋势

未来的技术将创建代谢途径的细胞编程应用程序，将能够模拟具有来自外部环境信号（QS）的多种生物相互作用的微生物联合体，这些类型的微生物联合体动态将允许发现广泛的新型高附加值生物复合物，可用于工业和生物医学应用，从而使生物精炼平台的设计成为可能。共培养系统的使用消除了灭菌过程的相关成本，因为它们可以成功地生产出无污染风险的生物复合物。必须强调的是，基于共培养过程的生物精炼厂的实施将产生积极的社会经济影响，主要是对农民，因为他们是最大的生物质生产商。从共培养中的生物化学和物理化学过程中开发新的数学模型将使微生物生长和生物复合物的生产自动化，以简化其放大实施。事实上，基于共培养系统的生物精炼厂将储存碳、氮、硫、磷等，通过循环生物经济生产氧气、能源和高附加值化合物，在循环生物经济中，自然资源不会面临完工风险。

12.结论

人类对保护自然资源和确保地球环境可持续性的兴趣与日俱增，这将导致研究多种物种共存的大型群落微生物生长的新方法，其中，由于共培养系统在生化平台上的生物精炼概念方面具有强大、模块化、可扩展和稳定的特点，因此，每种微生物都具有特定的活性，能够通过废物或有毒物质的生物降解获得一种或多种生物复合物，作为主要营养源，并以受控和可持续的方式获得。